EnglishPolski
Menu
Strona główna
Po co nam Bank DNA?
Biologiczna metka
Uczestnicy projektu
Bank DNA
Jak zbierać próbki?
Artykuły
Linki
Szukaj
Kontakt
Bannery
Jak zbierać próbki? Drukuj E-mail
Napisał: Webmaster   
poniedziałek, 22 grudzień 2008
Skuteczność barkodingu DNA zależy od jakości materiału biologicznego. Te proste instrukcje wskażą w jaki sposób właściwie udokumentować i przechować materiał do badań DNA.


Rośliny naczyniowe

Image Wysokiej jakości DNA najłatwiej można otrzymać z szybko wysuszonej tkanki roślinnej. Podczas zbiorów polowych na potrzeby analiz DNA botanicy w celu szybkiego wysuszenia materiału roślinnego rutynowo używają żelu krzemionkowego (Silica Gel).

1.    Stosunek objętości żelu krzemionkowego do tkanki roślinnej powinien wynosić 5-10:1. DNA najlepszej jakości uzyskuje się z tkanki, której wysuszenie nastąpiło w ciągu 24 godzin od zbioru.
2.    Zbierać należy młode, zielone i zdrowe fragmenty tkanki (najlepiej liście, jeśli to możliwe) z każdej rośliny osobno. 2-3 cm2 tkanki jest ilością wystarczającą do przeprowadzenia 1-2 izolacji DNA. Jednakże zawsze należy kierować się zasadą „Im więcej tym lepiej”.
3.    Po zebraniu prób tkanki, roślinę, z której ona pochodzi należy zabezpieczyć jako „voucher” zgodnie z metodyką zbierania egzemplarzy zielnikowych. Próby DNA bez powiązanego z nimi „vouchera” mają bardzo ograniczoną wartość w barkodingu DNA.
4.    Umieścić zbieraną tkankę roślinną w zamykanych woreczkach foliowych lub plastikowych buteleczkach wypełnionych żelem. Przed umieszczeniem prób w woreczkach należy rozdrobnić materiał roślinny na mniejsze części w celu zwiększenia powierzchni ekspozycji na żel silikonowy i tym sposobem przyspieszenia procesu wysychania.
5.    W trwały i jednoznaczny sposób oznaczyć opakowanie zawierające zebraną tkankę.
6.    Zebrane do żelu próby przechowywać z dala od źródeł wilgoci i nie doprowadzać do możliwości ich ponownego zawilgocenia. Należy pamiętać o kontroli stanu wilgotności żelu, w którym przechowywane są próby, i jego wymianie na świeży w przypadku zawilgocenia. Zaleca się stosowanie żelu silikonowego z indykatorem wilgoci, co ułatwi kontrolę stanu próbek. W przypadku długoterminowego przechowywania zaleca się ich zamrożenie.

Protokół roślinny (nieznacznie zmieniony) przygotowany przez Jeffa Saarela, Canadian Museum of Nature, Ottawa, Ontario, Kanada (jsaarela@mus-nature.ca).


Grzyby

ImageNajłatwiejszym sposobem utrwalania próbek grzybów jest ich suszenie przy pomocy żelu krzemionkowego stosowanego w taki sam sposób jak przy zbieraniu próbek roślin naczyniowych. Wyższej jakości DNA można uzyskać poprzez utrwalanie próbek grzybów w buforze litycznym CTAB [100mM Tris-HCL (pH 8), 1,4M NaCl, 2% CTAB (hexadecyltrimetyl-ammonium-bromide), 20mM EDTA oraz 0,2% ß-merkaptoetanol; ß-merkaptoetanol powinien być dodany do buforu CTAB jako ostatni ze składników, w miarę możliwości niedługo przed użyciem buforu]. Buforem napełnia się plastikowe probówki w których podczas zbiorów zamyka się zebrane próby.

Protokół grzybowy oparty na pracy Ronikier A. i Ronikier M. (2008) pt. „Badania mikologiczne w trudnych warunkach terenowych”. Str. 99-105, w  „Mykologiczne badania terenowe - Przewodnik metodyczny”. Wydawnictwo UMCS, Lublin.


Ssaki, ptaki, ryby i inne duże bezkręgowce

Image1.    W przypadku mniejszych osobników cały okaz zamrozić w plastikowej torebce. Na etykietce zaznaczyć numer okazu, symbol wyprawy, kod kraju, nazwę oraz długość i szerokość geograficzną lokalizacji, z której pochodzi dany okaz, datę, przypuszczalną nazwę gatunkową, oraz imię i nazwisko zbierającego. Tak opisaną próbkę należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze poniżej -20°C.
2.    Od dużych okazów, których zamrażanie nie jest celowe, należy pobrać małą ilość tkanki mięśniowej (wielkości około połowy kciuka) i zamrozić w oznaczonej, zamykającej się torebce plastikowej lub w probówce. Oznakować torebkę/probówkę jak wyżej. Okaz należy sfotografować. Ważne jest, aby na fotografii widoczne były cechy istotne do identyfikacji gatunku. Informacje o numerach próbek i fotografii powinny być ze sobą powiązane.
3.    Do przechowywania próbek nie stosować formaliny (a przynajmniej jej unikać).


Małe ryby i bezkręgowce

Image1.    Do utrwalenia i przechowywania stosować czysty 96% etanol (80%-85% do kruchych gatunków stawonogów). Nie stosować denaturatu.
2.    Oznakować próbki: numer okazu, symbol wyprawy, kod kraju, nazwę oraz długość i szerokość geograficzną lokalizacji pochodzenia okazu, datę, przypuszczalną nazwę gatunkową, oraz imię i nazwisko zbierającego.
3.    Jeżeli okaz zawiera dużo wody należy wymienić ciecz na świeży etanol po 1-2 dniach przechowywania okazu. Zawsze należy napełniać etanolem cały pojemnik, żeby uniknąć uszkodzenia próbek podczas transportu. Stosować etykietki z woskowanego papieru, notatki nanosić ołówkiem. Etykietkę umieścić w pojemniku z etanolem. Na etykietce zaznaczyć: numer okazu, symbol wyprawy, kod kraju, nazwę oraz długość i szerokość geograficzną lokalizacji, w której schwytano [znaleziono] okaz, datę, przypuszczalną nazwę gatunkową, oraz imię i nazwisko zbierającego.
4.    Przechowywać próbki w zimnym i ciemnym pomieszczeniu w celu uniknięcia degradacji DNA.

Jeżeli przechowywanie w etanolu jest niepraktyczne lub etanol w dużych ilościach jest niedostępny, od okazów można pobrać mniejsze próbki i przechowywać w mniejszej ilości etanolu. Informacje o pobranych próbkach i pierwotnej próbce powinny być ze sobą powiązane.

Roztwory formaldehydu prowadzą do tworzenia trwałych kompleksów DNA-białko. Jeżeli próbki muszą się znajdować w formaldehydzie, należy je przechowywać w zimnym pomieszczeniu i przenieść do etanolu tak szybko jak to jest możliwe, najlepiej przed upływem 14 dni. Po kilku dniach alkohol należy wymienić. Zanotować na etykietce, że próbka była przechowywana w formaldehydzie.

Okazy, które muszą być przechowywane w suchej formie do badań morfologicznych (np. motyle) należy przechowywać zamrożone (przy -20°C lub jeszcze w niższej temperaturze) lub szybko wysuszone w piecu lub inkubatorze.

Protokół zwierzęcy przygotowany przez Torbjorna Ekrema, Museum of Natural History and Archaeology, Trondheim, Norwegia (Torbjorn.Ekrem@vm.ntnu.no) i Petera Smitha, National Institute of Water & Atmospheric Research, Hamilton, Nowa Zelandia (p.smith@niwa.co.nz).